為了使農(nóng)藥殘留ELISA檢測(cè)試劑盒能夠被更多人了解，很好的應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化中，本公司集所有的研究人員進(jìn)行了這次大規(guī)模的研究，現(xiàn)將研究報(bào)告如下：
本研究以農(nóng)藥三唑磷及克百威為研究對(duì)象，采用分子模擬方法對(duì)其半抗原分子進(jìn)行了設(shè)計(jì)并合成得到了兩種優(yōu)化的三唑磷半抗原兩種半抗原O-乙基，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基），N-（3-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THBu）、O-乙基，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基）,N-（5-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THHe）和一種克百威半抗原4—[[（2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧）羰基]氨基]丁酸（BFNB）。上述半抗原分別與載體蛋白偶聯(lián)制備成人工抗原，免疫小白鼠，再采用雜交瘤技術(shù)制備出了對(duì)應(yīng)單克隆抗體。經(jīng)測(cè)定，抗體（腹水）的效價(jià)均在10~6以上，與對(duì)應(yīng)農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均較低，表現(xiàn)出很高的特異性。在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)固相載體、包被緩沖液、有機(jī)溶劑、包被條件、洗滌次數(shù)、酶的種類、封閉物種類、點(diǎn)板時(shí)間、工作濃度、穩(wěn)定劑以及不同ELISA模式等因素的篩選比較，優(yōu)化了三唑磷和克百威ELISA檢測(cè)試劑盒方法和條件。
優(yōu)化后結(jié)果顯示：
1、Costar酶標(biāo)板（美國）吸附效果和均一性較好；
2、抗體以PBS（pH 7.4，0.01M）作為包被介質(zhì)較為理想，人工抗原則以CBS（pH 9.5，0.05M）作為包被介質(zhì)較為理想；
3、包被條件以在37℃下包被2h效果為佳；
4、反應(yīng)介質(zhì)加入2％牛奶可減少非特異性吸附，提高檢測(cè)靈敏度；
5、有機(jī)溶劑中甲醇對(duì)ELISA反應(yīng)的影響較小，反應(yīng)體系中zui終含量10％為佳；
6、HRP酶作為顯色反應(yīng)的催化劑比AP酶更為理想；
7、包被抗原直接競爭ELISA模式OD值的平行性不如包被抗體直接競爭ELISA模式的好；
在以上條件下優(yōu)化出的穩(wěn)定劑可使包被在酶標(biāo)板上的抗體在37±1℃條件下保存14天而抗體活性基本保持不變。
利用優(yōu)化后的分析條件，建立了農(nóng)藥三唑磷異源直接競爭ELISA方法（包被抗體模式）和克百威直接競爭ELISA方法（包被二抗模式）。在考察了不同樣品基質(zhì)對(duì)ELISA方法的影響后，進(jìn)一步對(duì)蔬菜樣品、水果樣品、水、土等環(huán)境樣品進(jìn)行了三唑磷和克百威添加回收率試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，考察了方法的準(zhǔn)確度與精密度，并對(duì)不同處理組間、相同處理組板間的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，確定了不同樣品的方法本底值、zui低檢測(cè)限及檢測(cè)結(jié)果陰性／陽性判定方法，zui終構(gòu)建了三唑磷ELISA快速測(cè)定試劑盒和克百威ELISA檢測(cè)試劑盒。
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